TAcloning做不出來..... - 抗生素

By Christine
at 2008-06-07T00:00

Table of Contents

我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning
用Tag P出我的要的片段,約1800b.p
加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
(22度西 30分鐘)
接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體
(養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀)
抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了
不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了
謝謝~
Update:
因為用的量很多,為了省錢所以competent cell就自己做了,我有做膠回收,位置也都對,謝謝~
Update 2:
PCR部分應該沒有問題,因為是照paper做的,位置也都對,所以應該是沒問題的,謝謝~

Tags: 抗生素

All Comments

By Liam
at 2008-06-08T08:13

可建議降低酵素作用溫度且加長作用時間
NEB 或是生工公司的T4 DNA ligase可使用17度 overnigth去試試看
若是買RBC-T4 DNA ligase 可降低溫度到4度 overnight去試試看
RBC T4 DNA ligase 的效率比NEB還有生工的好不少倒是真的~
(只是價錢差很多)
----
抽值體的部份，若真的都不放心kit是否品質OK
可是著用 phenol/CHCl3 去抽抽看~(速度慢但至少比較保險一些)
若是想加快速度可是著用colony直接跑PCR的方式去找是否有insert
做法如下:
取一個牙籤量的colony(太多也不好，這個做法比較難的就只有這)
在PCR-tube中加入10 ul 水，把牙籤放到裡面混勻
把試管放到機器中95度 10~15分鐘(破菌

By Kama
at 2008-06-07T15:50

1. 初學最好測insert 濃度, 依照protocol建議作.
2. ligation後取一些跑膠看使否有supercoil 出現.
3. 自己做的competent cell最好用其他vector測transformation效率.
4. 長的colony抽不出質體?? 直接用未transform competent cell 作, 看是否有污染, 是否是操作污染.
5. 請同學幫忙作一次, 看是否自己有沒注意到的細節.

By John
at 2008-06-10T14:56

首先先確定你PCR的產物，長度與你的預期相同
在經過 gel extraction，把你的產物於雜bands 分離
就TA cloning的部份，步驟並沒有什麼不對，
但是我們的經驗，自己做的competent cell效果並不是很好
況且competent cell製作很繁瑣，建議直接用廠商的
不是很清楚大大您的狀況，希望上述的經驗能幫助您..

By Una
at 2008-06-09T16:41

可以列一下你的PCR program嗎?
我想從第一步開始看更會明白

By Liam
at 2008-06-09T18:16

1. 有確定過insert的濃度？
2. 有確定過competent cell的效率？
3. 可以試試16度ligation o/n
4. Km 塗盤前有預養？
我記得topo有給competent cell，那個效果非常好

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