我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning
用Tag P出我的要的片段,約1800b.p
加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
(22度西 30分鐘)
接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體
(養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀)
抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了
不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了
謝謝~
Update:
因為用的量很多,為了省錢所以competent cell就自己做了,我有做膠回收,位置也都對,謝謝~
Update 2:
PCR部分應該沒有問題,因為是照paper做的,位置也都對,所以應該是沒問題的,謝謝~
用Tag P出我的要的片段,約1800b.p
加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
(22度西 30分鐘)
接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體
(養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀)
抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了
不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了
謝謝~
Update:
因為用的量很多,為了省錢所以competent cell就自己做了,我有做膠回收,位置也都對,謝謝~
Update 2:
PCR部分應該沒有問題,因為是照paper做的,位置也都對,所以應該是沒問題的,謝謝~
All Comments
NEB 或是生工 公司的T4 DNA ligase可使用17度 overnigth去試試看
若是買RBC-T4 DNA ligase 可降低溫度到4度 overnight去試試看
RBC T4 DNA ligase 的效率比NEB還有生工的好不少倒是真的~
(只是價錢差很多)
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抽值體的部份，若真的都不放心kit是否品質OK
可是著用 phenol/CHCl3 去抽抽看~(速度慢 但至少比較保險一些)
若是想加快速度 可是著用colony直接跑PCR的方式去找是否有insert
做法如下:
取一個牙籤量的colony(太多也不好，這個做法比較難的就只有這)
在PCR-tube中加入10 ul 水，把牙籤放到裡面混勻
把試管 放到機器中95度 10~15分鐘(破菌
2. ligation後取一些跑膠看使否有supercoil 出現.
3. 自己做的competent cell最好用其他vector測transformation效率.
4. 長的colony抽不出質體?? 直接用未transform competent cell 作, 看是否有污染, 是否是操作污染.
5. 請同學幫忙作一次, 看是否自己有沒注意到的細節.
在經過 gel extraction，把你的產物於雜bands 分離
就TA cloning的部份，步驟並沒有什麼不對，
但是我們的經驗，自己做的competent cell效果並不是很好
況且competent cell製作很繁瑣，建議直接用廠商的
不是很清楚大大您的狀況，希望上述的經驗能幫助您..
我想從第一步開始看更會明白
2. 有確定過competent cell的效率？
3. 可以試試16度ligation o/n
4. Km 塗盤前有預養？
我記得topo有給competent cell，那個效果非常好