DNA重組技術--藍白細胞篩選法 - 抗生素
By Genevieve
at 2007-10-29T00:00
at 2007-10-29T00:00
Table of Contents
經DNA限制酶和連接酶處理過的載體經由轉形或電穿孔作用植入目標細胞後 . 需經過篩選後 . 才能得到重組型細胞
此篩選法分多種 :
目前知道的有抗生素篩選法
及藍白細胞篩選法
請敘述其原理~
已更新項目:
試問X-gal與β-galactosidase 的關係
2 個已更新項目:
那圖看不懂
3 個已更新項目:
可否解釋更詳細?
此篩選法分多種 :
目前知道的有抗生素篩選法
及藍白細胞篩選法
請敘述其原理~
已更新項目:
試問X-gal與β-galactosidase 的關係
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那圖看不懂
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可否解釋更詳細?
Tags:
抗生素
All Comments
By Odelette
at 2007-10-31T23:04
at 2007-10-31T23:04
抗生素篩選,藍白篩選,養分篩選...
為什麼會用這些方式篩選...?
是因為轉殖基因到細胞或細菌時...所使用的載體
載體不同,篩選方式也不同...
載體的必備條件...
1.具有能夠表現轉殖基因的promoter...
2.具有能夠自我複製的複製起始點...
3.基因接入點(Multiple cloning site)
4.具有篩選時,需要的marker gene...
這個marker就是決定要如何篩選的依據...
大多數載體都會帶有抗抗生素的基因...
例如以下是pCMV-TAP 的map
圖片參考：http://www.narrador.embl-heidelberg.de/GroupPages/...
我們可以在map中看到kan r/neo r
kan 是指抗生素 kanamycin, neo是指neomycin...,r是resistance ...
表示這個載體所帶的抗藥性基因是可以抵抗kanamycin和neomycin的抗藥基因...
帶有這個載體的細菌可以抵抗kanamycin和neomycin...
帶有這個載體的細胞可以抵抗G418和neomycin...
而藍白篩選是因為所使用的載體中,
帶有lacZ基因...可以產生β-galactosidase ...
然後我們可以在培養基中加入X-gal solution...
當X-gal遇到β-galactosidase ...發生作用
圖片參考：http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/5/5b/X-ga...
產生藍色的產物沉澱...
所以我們可以在帶有這個載體的細胞或細菌上,呈現藍色...
例如以下這個載體...
圖片參考：http://www.qbiogene.com/products/gene-expression/q...
帶有lacZ基因...
當送進細胞後,就能用x-gal呈色...
帶有這個載體的會呈現藍色...
還有一個營養篩選...
你有需要再補充吧...
希望對你有幫助
2007-11-01 00:10:06 補充：
lacZ基因lac operon的三個 structural genes之ㄧ
lacZ基因經過轉錄轉譯產生β-galactosidase ...
用來水解 β-galactosides,並將β-galactosides分解成 monosaccharides...
而X-gal其實是屬於galactoside...
X-gal的全名是5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-galactopyranoside...
會被β-galactosidase 水解...成兩個次單位...
2007-11-01 00:10:13 補充：
所以上面那張圖的意思是
X-gal遇到β-galactosidase ...會將其水解成兩個次單位
產生5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole 和galactose
5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole 會很快的氧化產生 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo...
5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo是非水溶性的藍色沉澱...
所以細胞或細菌可以顯現出藍色...作為篩選依據
2007-11-01 00:16:00 補充：
注意這兩個字喔
β-galactosides...這是半乳糖苷
β-galactosidase...這是 半乳醣苷酶
別看錯了
字尾是-ase的字通常是酵素名稱....
By Anonymous
at 2007-11-02T03:47
at 2007-11-02T03:47
就是選沒有抗藥性的細胞 ＆
選有抗藥性的載體
這樣 沒抗藥性的細胞 只有被殖入有抗藥性的載體 才有抗藥性 才能存活下來
沒有被殖入的 自然就被淘汰掉了～
藍白細胞篩選
主要在 載體是否被接上DNA
有被接上DNA的 不會產生藍色
沒被接上DNA 的載體 就會被染成藍色
所以 通常在篩選 是否接上DNA 實驗時
兩個過程是同時進行
即 洋菜膠裡 既加了抗生素 也加了染色劑
這樣 一方面篩選掉不要的細胞 能夠確定 有載體殖入細胞內
也同時也篩選掉沒有接入DNA的載體 容易選擇 你DNA 確實接入載體的細胞
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